Refrigerador

Ultracongelador

Desmineralizador por intercambio de iones

Desionizador y destilador

Destilador de agua

Algunos datos sobre el agua:

Un destilador produce de uno a varios litros de agua destilada por hora. En la mayoría de los casos el agua destilada es suficientemente pura para realizar Cultivos in vitro, pero puede llevar determinados aniones y cationes, y tener una cierta carga. Cuando se necesita agua de mayor pureza se puede bidestilar el agua.

También puede usarse agua desionizada, conocida como agua Millipore, que se obtiene tratando el agua corriente en un equipo con varias columnas; las primeras filtran sólidos en suspensión y las siguientes son intercambiadores de tipo iónico que retienen aniones y cationes. Su pureza se cuantifica según su resistividad. Una de sus ventajas es la capacidad de obtenerla inmediatamente, y por eso no hay que almacenarla. Un inconveniente es la necesidad de recambiar los filtros con determinada periodicidad, y otro el que su pureza evoluciona en el tiempo al irse saturando los filtros.

Los bisturís: serán de varios usos, por lo que son de acero inoxidable. Es importante recambiarlos antes de que el filo se erosione, para evitar producir daños en los explantos adicionales a los de un buen corte, lo que puede causar respuestas celulares que influyan negativamente en el proceso de cultivo in vitro. La forma y el tamaño de los bisturís será tal que optimice la extracción de los explantos en función del tipo de material vegetal inicialmente disponible.

Diferentes tipos de bisturis y pinzas.

Distintos modelos de hojas de bisturí.

Las pinzas: su uso permite la correcta colocación de los tejidos sobre el medio de cultivo, o la extracción de un fragmento del material vegetal. Su tamaño y forma están supeditados al tamaño del material a manipular, a la posible utilización de equipos tales como lupas binoculares, y a su capacidad en cada caso para sujetar con firmeza el material que se manipula sin llegar a dañarlo.

Tanto pinzas como bisturís deben ser fácilmente esterilizables.

Los requisitos fundamentales de los recipientes de cultivo determinan su existencia:

• Poder disponer de él en forma estéril - Mantenimiento en esterilidad durante el cultivo del explanto.
• Posibilidad de reutilización
• Transparencia del material, que permitirá visualizar el desarrollo del explanto, y que pueda realizar fotosíntesis
• Capacidad de mantenerse en estado inerte (no intercambiar compuestos de ningún tipo)
• No deformación tras sucesivas esterilizaciones,
• Resistencia a impactos
• Permitir intercambiar gases con el exterior sin que se contamine
• Simplicidad de su uso
• Fácil disponibilidad
• Bajo coste.

Los materiales que cumplirán son principalmente el vidrio Pyrex o similar y algunos plásticos. El vidrio es probablemente el mejor material en cuanto a transparencia, mantenimiento inerte y sin deformar, etc. Sus mayores desventajas con su fragilidad y su coste. Los plásticos mas utilizados son poliestireno, polipropileno y policarbonato. El poliestireno se utiliza para las placas Petri y recipientes de un solo uso; es transparente, pero quebradizo y no resiste el calor. El polipropileno es flexible, y translúcido pero no transparente; y puede esterilizarse un buen número de veces. El policarbonato es rígido, totalmente transparente y algo quebradizo; puede esterilizarse repetidamente sin perder transparencia, pero tiene un mayor coste. (se puede poner un listado y acompañar de fotos, si es posible que no sean de cultivo in vitro sino de un uso común del material). Existen recipientes que combinan un material para el contenedor y otro para su tapa. Al decidir el tipo de recipientes debe considerarse el tipo de explanto a cultivar y el desarrollo que debe tener.

Placas de Petri

Cajas Magenta

Erlenmeyer con tapán

Bolsas de cultivo de un solo uso

Recipientes de cultivo de vidrio

Tubos de cultivo con tapón

"Baby food"

Cajas de cultivo

Las posibilidades de tipos de recipientes en el mercado son amplias, y van desde los que se utilizan en investigaciones puntuales con células aisladas a los requeridos en grandes cantidades para micropropagación comercial.

Algunos recipientes requieren de soportes (gradillas)

Gradillas metálicas

Gradillas de plástico

Una categoría particular de sistema de cultivo que manipula el tipo de recipiente lo constituye el cultivo en membranas flotantes parcialmente porosas, que se introducen sobre un flotador dentro de algunos recipientes. Membranas y flotadores son autoclavables. Los explantos se colocan dentro de la balsa y toman los nutrientes del medio líquido por capilaridad

El instrumental con el que se realizan cultivos asépticos no debe ser portador de organismos contaminantes del cultivo. Junto a la esterilización del instrumental también se realiza la del medio de cultivo.

Los agentes contaminantes: Pueden ser de varios tipos: los contaminantes no bióticos, que no pueden ser eliminados mediante la esterilización, y los bióticos, que sí pueden eliminarse mediante esterilización.

Existirá una contaminación biótica si en el medio de cultivo se desarrolla algún otro tipo de ser vivo que no sea el explanto. Los contaminantes bióticos suelen ser hongos, bacterias, algas, protozoos u otros pequeños organismos vivos. Los virus no se consideran contaminantes bióticos porque no son organismos vivos independientes, y por tanto su presencia no se controla mediante esterilización.

Para saber cómo evitar la contaminación debemos tener en cuenta:

• El tamaño y abundancia de los diferentes contaminantes bióticos
• El efecto perjudicial de las altas temperaturas sobre los seres vivos; los sistemas de esterilización toman como base la aplicación de calor.

El “calor seco” daña irreversiblemente a los microorganismos si se aplican temperaturas muy altas durante un tiempo prolongado, por ejemplo 240ºC durante 24 a 48h. Este sistema de esterilización es poco eficiente. Por el contrario, el calor húmedo aplicado a alta presión elimina todas las formas de vida en un tiempo mucho más breve. Para manipularlo se han diseñado los autoclaves, que son recipientes que se saturan con vapor de agua a alta temperatura de forma que la presión en el interior del autoclave aumenta, y por lo tanto todo el agua que pueda contener entra en ebullición a temperaturas superiores a los 100ºC. Bajo estas condiciones se elimina toda forma de vida en unos pocos minutos.

El autoclave es el método de esterilización mas utilizado para medios de cultivo, recipientes y utensilios. Para controlar el binomio tiempo-temperatura deben realizarse estimaciones de la temperatura alcanzada en cada momento por nuestros materiales.

En la práctica cada vez se esterilizan diferentes conjuntos de materiales y volúmenes de medios de cultivo y estos cálculos se hacen muy difíciles, por lo que dentro de unos rangos se esteriliza ligeramente es exceso. La selección estándar para cultivos in vitro de tejidos vegetales es de 121ºC durante 20 min de esterilización.

Autoclave horizontal

Autoclaves verticales

Detalle del calderin

Controles del autoclave

¿Y si los materiales no resisten el calentamiento? Es el caso de algunos plásticos que deben esterilizarse por métodos alternativos, entre ellos la esterilización por inmersión en soluciones o atmósferas esterilizantes, por ejemplo en etanol. Este sistema es costoso económicamente y puede dejar residuos de etanol que afecten negativamente al desarrollo de los explantos, por lo que no suele aplicarse. Otro sistema que no deja residuos es la esterilización por rayos gamma, que destruyen todo vestigio de vida. Un equipo de rayos gamma es costoso y complejo, y solo es adecuado para esterilizar cantidades importantes de materiales, como algunos tipos de plásticos que constituyen recipientes de un solo uno y que tras recibir los rayos gamma se envasan en bolsas plásticas dentro de una atmósfera inerte.

La cabina de flujo laminar es el lugar en que se realizan los cultivos. Es una superficie sobre la que trabajar de forma que las condiciones de esterilidad ambiental queden aseguradas, si todo lo que utilizamos está estéril el resultado debe ser un cultivo estéril.

Antiguamente en microbiología se trabajaba en el interior de un espacio limitado por mecheros encendidos. Para explantos vegetales sin embargo se precisa asegurar la esterilidad total, que fue posible en cajas cerradas cuya atmósfera se saturaba con etanol, pero el sistema era muy limitante; posteriormente el sistema se mejoró y ya no eran herméticas sino con aperturas al exterior, permitiendo el trabajo a una escala mayor y de forma mas continuada.

Finalmente la fabricación de filtros de tamaño de poro muy pequeño (0, 22 µm) a través de los que puede impulsarse una corriente de aire ha dado lugar a lo que se conoce como cabinas de flujo laminar. En ellas hay unos prefiltros que retienen partículas relativamente grandes y otros filtros que retienen los agentes contaminantes celulares (hongos y bacterias, incluidas las esporas). El aire que atraviesa estos filtros sale sobre la superficie de trabajo de la cabina en un estado laminar, lo que impide la entrada de agentes contaminantes desde el exterior, lográndose un espacio de trabajo estéril aunque abierto al exterior. Existen cabinas de flujo vertical, cuyo uso preferente es el ámbito hospitalario de microbiología, y las de flujo horizontal, utilizadas para el cultivo de tejidos vegetales. La diferencia fundamental entre ambas radica en el sentido del flujo laminar, que hace que el aire de la zona de trabajo llegue o no al personal que realiza el cultivo.

Cabina de flujo laminar horizontal (izquierda), controles (centro) y filtro interior (derecha)

Cabina de flujo laminar vertical (izquierda), esquema (centro) y detalle del interior (derecha)

Cabinas de flujo laminar portátiles: son una adaptación de las cabinas de flujo que permiten iniciar un cultivo in vitro en zonas sin instalaciones especializadas, tales como toma de muestras in situ o conservación de germoplasma.

Cabina de flujo portátil.

Una sala de incubacián es un recinto de tamaño de menos de 1 m cuadrado, a una gran sala de 20 o más metros cuadrados, en la que se controlan las condiciones ambientales básicas que afectan al desarrollo de los vegetales: luz, temperatura y humedad relativa.

Sala de incubación.

Equipo de climatización de una sala de incubación

Cámara de incubación con iluminación cenital.

Cámara de incubación con iluminación frontal

Este es un tema clásico de Fisiología Vegetal. Las plantas necesitan luz para realizar fotosíntesis: fijar el CO2 atmosférico y producir monosacáridos que se distribuyen por la planta para formar el resto de los compuestos por diferentes rutas metabólicas. Debemos saber cómo debe ser la luz para que permita la fotosíntesis. Por otra parte la fotosíntesis no explica todo el desarrollo vegetal, sino que existen procesos de diferenciación afectados en distinto grado por la luz, tales como la floración, el desarrollo radical, la ramificación, o el alargamiento internodal.

¿Es importante la fotosíntesis in vitro?, ¿necesitamos algún proceso fotomorfogénico o solamente crecimiento?. El desarrollo in vitro estrictamente puede producirse en oscuridad, pero en la mayoría de los casos se necesita luz para conseguir el adecuado desarrollo, claramente cuando deben multiplicarse plantas. Las plantas realizan fotosíntesis mediante la absorción de fotones de luz azul y de luz roja; al iluminar la cámara de incubación debemos considerar el espectro de la fuente luminosa.

¿De qué fuentes luminosas podemos disponer? Hay lámparas incandescentes, vulgarmente llamadas “bombillas”, que emiten radiación luminosa de una forma muy parecida al espectro solar, pero gran parte de la energía que consumen se disipa como calor, del que es conveniente prescindir. Las lámparas fluorescentes no emiten prácticamente radiación en el Infrarrojo sino en la parte de la energía radiante correspondiente al espectro visible, del violeta al rojo (se pueden tocar sin quemarnos). Ni las bombillas incandescentes ni las lámparas fluorescentes emiten radiación UV (salvo lámparas específicas).

Lámpara de incandescencia y lámpara fluorescente

Espectro de emisión de distintos tipos de lámparas

Existen distintos tipos de fluorescentes. Los de luz “blanca de día”, se parecen mas a la luz solar que la de otros fluorescentes por tener una importante proporción de amarillo, que no utilizarán las plantas. Los fluorescentes de “luz blanca fría” están algo enriquecidos en tonos azules, son adecuados desde el punto de vista de la eficiencia fotosintética; aún mas eficientes para la planta son los fluorescentes “gro-lux”, que emiten luz principalmente en la zona del azul y en la del rojo y que por ello vemos su luz de color ligeramente rosado o violáceo. Otros tipos de lámparas no son utilizadas enlas cámaras de incubación.

En cuanto a la fotomorfogénesis hay pocos casos en que se considere, si bien debe recordarse que según la mayor o menor abundancia de iluminación en tonos azules frente a la de los rojos será más fácil el desarrollo de tallos que el de raíces, o viceversa.

Hemos hablado del espectro de luz que necesitamos, pero esto no lo es todo; otros aspectos importantes de la luz a controlar son:

• La dirección desde la que las plantas reciben la luz: en condiciones naturales va cambiando el ángulo, mientras que en los cultivos in vitro es fija, y cenital o lateral. La luz lateral siendo poco natural no tiene efectos graves pero es difícil proporcionarla homogéneamente; la cenital es sensiblemente mejor, aunque también resulta difícil evitar los gradientes de luz

Distribución de la luz en una cámara de incubación con iluminación zenital (izquierda) y lateral (derecha).

• El fotoperiodo: las plantas de las distintas especies responden al fotoperiodo en cuanto a diferenciación, si bien normalmente éste no afecta a los aspectos mas relacionados con el crecimiento. La fotosíntesis realizada es proporcional a la cantidad total de luz recibida por la planta; como la iluminación de la cámara de incubación representa un pequeño porcentaje de la luz solar, su limitación se tiende a compensar prolongando el fotoperiodo in vitro a 16 ó incluso 18h de luz al día. Serán excepciones todos los procesos sensibles al fotoperiodo (por ejemplo los tubérculos de las patatas). (poner imágenes o simulaciones de iluminación de diferentes cámaras de cultivo). En cualquier caso la iluminación debe ser homogénea en todo lugar de la cámara en que puedan situarse cultivos in vitro.

Habitualmente se simulan condiciones naturales combinando el fotoperiodo con el termoperiodo; así también se reduce el consumo energético y se alarga la vida de la cámara. La temperatura de la cámara debe ser precisa y homogénea, y debemos conocer que el diseño de las cámaras puede causar graves problemas. (Uno de estos problemas lo podemos apreciar en la figura siguiente). Un pequeño cambio de diseño del interior de esta cámara hizo posible que la temperatura de crecimiento de los explantos fuera la realmente programada.

Variación de la temperatura y iluminación en una cámara de incubación.

Recordaremos también que en el interior de los recipientes la temperatura puede ser superior a la ambiental, y que durante el periodo diurno de la cámara la fuente de luz produce cierto calor que debe disiparse. Si el calor se transmite a los estantes de la cámara, y de éstos a la base de los recipientes, se produce un calentamiento basal que favorece la formación de raíces y hace condensar vapor de agua sobre las tapas de los recipientes, tanto mas cuanta mayor superficie y menor altura tengan estos. Esta situación es perjudicial para el desarrollo del cultivo.

En general la temperatura adecuada para un cultivo será la óptima para la especie concreta y el estado de desarrollo concreto a conseguir.

La humedad ambiental es relevante para el desarrollo de plantas enteras en condiciones naturales, y también para el desarrollo in vitro. En el cultivo in vitro la humedad del “sustrato” es “a saturación”, y también la humedad ambiental del interior de los recipientes herméticamente cerrados; en cualquier caso es siempre muy alta. Se recomienda evitar recipientes herméticos; aunque si el ambiente de la cámara de cultivo es seco el medio se irá secando con relativa rapidez. Una buena cámara de incubación incluye un control de la humedad relativa en su interior, y ésta se debe situar alrededor del XX %.

El control de la humedad relativa del ambiente es muy complejo; sen muchos casos es suficiente dotar a la cámara con humidificadores y registrar la humedad relativa de forma que se encuentre dentro de un rango. El exceso de humedad afecta negativamente a los sistemas eléctricos de la cámara y favorece la proliferación de organismos contaminantes.