4.1Introducción. Terminología
4.2 Necesidad de la esterilización in vitro
4.3 Procedimientos de esterilización del material vegetal
    4.3.1 Procedimiento de esterilización convencional
    4.3.2 Procedimientos para mejorar la penetración del agente esterilizante.
    4.3.3 Tratamientos previos a la esterilización
    4.3.4 Esterilización de explantos de muy pequeño tamaño
4.4 Procedimientos de esterilización de instrumental
4.5 Procedimientos de esterilización del medio de cultivo
4.6 Aparición de contaminantes. Causas

Habitualmente se dice que los cultivos in vitro de tejidos vegetales se realizan en condiciones de asepsia o de esterilidad. Asepsia indica que se han eliminado la mayoría de los organismos vivos, mientas que esterilidad indica ausencia total de todo organismo vivo. En general sin embargo se admite la utilización del término “esterilización” del material vegetal.

Para cultivar in vitro tejidos vegetales deben eliminarse todas las fuentes de contaminación. El término esterilidad en este caso indicará que se han eliminado todas las formas de vida excepto el material vegetal. En algunos casos concretos también interesa que otros organismos convivan con el explanto (por ejemplo bacterias portadoras de determinados plásmidos durante un proceso de transformación genética).

De todos los pequeños organismos que pueden asociarse a una planta, los mayores (nemátodos, ácaros, etc) quedarán eliminados al tomar y limpiar el material vegetal. Las partículas que precisan introducirse en las células para realizar actividades metabólicas, tales como virus y equivalentes no se pueden eliminar por esterilización. Los microorganismos susceptibles de ser eliminados por esterilización son los hongos, levaduras y bacterias de cualquier tipo.

El material vegetal es esterilizado en superficie. Cualquier organismo que se encuentre en su interior, tales como las bacterias endógenas, permanecerá y podrá producir problemas de contaminación posterior; en el mejor de los casos se controlarán mediante adición de antibióticos al medio de cultivo.

¿Qué hay que esterilizar? ¿Por qué hay que esterilizar?, y ¿hay que esterilizar siempre?.

Las causas por las que se puede contaminar un cultivo in vitro son:

• El recipiente con medio de cultivo
• El intrumental utilizado
• El material vegetal utilizado
• La inadecuación del agente esterilizante
• La falta de contacto entre el agente esterilizante y el material vegetal
• El incorrecto funcionamiento de la cabina de flujo
• Las condiciones de las salas de incubación La incorrecta manipulación y control posterior

Idealmente el material vegetal se habrá desarrollado en condiciones totalmente controladas, incluyendo que contenga la mínima cantidad de agentes contaminantes (por ejemplo planta entera cultivada en un invernadero).

Se dispone de un material vegetal escasamente contaminado y sin problemas físicos concretos que dificulten la esterilización. Debe ponerse en contacto el material vegetal con los agentes esterilizantes, durante el tiempo mínimo que elimine los contaminantes. En la práctica: se prepara la solución con el compuesto esterilizante y un mojante, se sumerge en ella el material vegetal un tiempo; se introduce en la cabina de flujo laminar y se elimina la solución esterilizante mediante lavados con agua estéril. Se eliminan los fragmentos vegetales dañados por la esterilización y cultivar el resto del material vegetal como estuviera previsto.

Los mojantes son agentes tensioactivo; disminuyen la tensión superficial de la solución acuosa esterilizante y así facilitan el contacto de esta con el material vegetal.

Agente mojante	%
Teepol	0.05-0.1
Lissapol F	0.05-0.1
Tween 20	0.05-0.1
Tween 80	0.01-0.05
7X	0.1
Alconox	0.2

 

¿Qué agentes esterilizantes podemos utilizar?

Existen un número reducido de compuestos capaces de eliminar a los contaminantes.

Agente	Concentración típica (%)	Facilidad de eliminación	Tiempo de exposición(m)	Efectividad**
Hiplocorito cálcico	9-10	3	5-30	Muy buena
Hipoclorito sódico	2*	3	5-30	Muy buena
Peróxido de hidrógeno	10-12	5	5-15	Buena
Agua de bromurada	1-2	3	2-10	Muy buena
Nitrato de plata	1	1	5-30	Buena
Cloruro de mercurio	0.1-1	1	2-10	Satisfactoria
* 20% v/v de producto comercial **1 = muy difícil; 5 = muy fácil de eliminar despues de la esterilización

Todos los agentes esterilizantes afectan al explanto material vegetal proporcionalmente al tiempo que están en contacto con él. Un tratamiento típico de esterilización del material vegetal es la inmersión durante 10 minutos en una solución de lejía comercial.

¿Cuáles serán las pérdidas por contaminaciones? Depende del origen del material vegetal, el agente esterilizante, el mojante, el procedimiento en conjunto y el sistema de cultivo utilizado. Sin esterilización se contaminarán todos los explantos, pero incluso con ella las pérdidas pueden llegar al 90%. Un buen procedimiento debería dar porcentajes de contaminación no superiores al 5-10%.

Cuando la superficie del material vegetal es irregular su contacto con la solución esterilizante puede no ser total; pueden quedar zonas con burbujas de aire que no se esterilicen y que luego harán que se contamine el cultivo. ¿Qué hacer en estos casos?:

• Agitar vigorosamente al explanto durante parte del tiempo de inmersión en la solución esterilizante es lo mas sencillo.
• Realizar la “esterilización a vacío” para forzar la salida de aire de toda la superficie del explanto, que queda sustituída por solución esterilizante.

La efectividad de la esterilización aumenta con la concentración del agente esterilizante y con el tiempo de esterilización. Sin embargo cuando tenemos que partir de material material de campo fuertemente contaminado esto no es suficiente porque exigiría tratamientos que dañarían irreversiblemente al explanto. En estas situaciones se debe reducir la carga contaminante antes de iniciar la esterilización del material vegetal, mediante “pretratamientos” que básicamente son:

• Lavado del material vegetal con un cepillo, agua y jabón. No recomendado en materiales poco resistentes o si el lavado puede facilitar la penetración de los agentes contaminantes al interior del explanto.
• Pre-esterilización del material vegetal mediante inmersión breve (menos de 2 min. en solución alcohólica suave (70-80% de etanol), que puede acompañarse de agitación. Esto elimina gran número de contaminantes superficiales y erosiona las capas de ceras de la superficie del explanto, facilitando también su contacto con la solución esterilizante. Si esta preesterilización se prolonga puede dañar irreversiblemente al explanto por deshidratación.
• Aislamiento previo del material vegetal de partida. Se toma del campo pero antes de realizar el cultivo in vitro se cultiva un fragmento grande de la planta, incluso idealmente la planta entera, un tiempo en un ambiente controlado, en el que además pueda ser sometido a diferentes tratamientos de desinfección. Alternativamente se puede aislar físicamente in situ un fragmento de la planta (por ejemplo con bolsas de plástico transparentes) y tratarlo con algún tipo de compuestos desinfectantes.

Cuando necesitamos cultivar in vitro fragmentos de tamaño muy pequeño debemos primero esterilizar un fragmento grande y luego fraccionarlo. Si el material vegetal de partida es muy pequeño, por ejemplo semillas, debemos disponer de un sistema que las retenga durante las diversas inmersiones y que se pueda utilizar con un gran número de fragmentos de dicho tamaño simultáneamente: mallas o redes de retención de los materiales vegetales.

El instrumental será esterilizado mediante el autoclave, de acuerdo con lo explicado en el capítulo anterior. Si no es resistente a las altas temperaturas puede ser esterilizado por un equipo de rayos gamma (ejemplo placas Petri) o por inmersión en una solución esterilizante. La esterilización de superficies lisas, tales como la de la cabina de flujo laminar, puede realizarse también mediante exposición a radiaciones UV.

El medio de cultivo se esteriliza habitualmente en autoclave. Algunos componentes pueden degradarse por calor, lo que requiere disponer de otras alternativas:

• Si el porcentaje de degradación del compuesto es muy bajo, o los productos de su degradación son tan efectivos como el compuesto inicial puede prescindirse de medidas alternativas de esterilización, y autoclavarlo normalmente.

• Si el porcentaje de degradación del compuesto es alto, y los productos de su degradación no son efectivos, debe esterilizarse mediante filtración. Se disuelve el compuesto termodegradable en un pequeño volumen de agua y el resto se esteriliza el recipiente general con el resto del medio de cultivo, dejándolo enfriar hasta estar tibio. En ese momento, y dentro de la cabina de flujo laminar, se filtra la solución termosensible a través de una membrana estéril de tamaño de poro de 0,22 µm de diámetro, se deja caer sobre el medio general ya estéril, se agita para mezclar ambas soluciones y se reparte en los recipientes. El filtrado utiliza jeringas si el volumen a filtrar el pequeño, o Erlenmeyers con boquillas de filtrado si el volumen es mayor.

Si tras la esterilización y cultivo no conseguimos eliminar los agentes contaminantes, al cabo de un tiempo, se desarrollarán hongos, levaduras o bacterias que impedirán proseguir con el cultivo del material vegetal, la mayoría en las dos primeras semanas de cultivo.

Debe analizarse la causa de la contaminación para poder establecer un nuevo sistema de esterilización efectiva; ésta puede radicar en:

• El recipiente con medio de cultivo
• El material vegetal
• El tipo de agente esterilizante
• El contacto agente esterilizante-material vegetal, la penetración del agente esterilizante
• La cabina de flujo Las salas de incubación
• El operador y su sistema de trabajo
• Causas externas

Se debe distinguir el tipo de agente contaminante (hongo, bacteria, levadura) por el aspecto y evolución de la contaminación.

La localización de la aparición de las contaminaciones también es esencial para conocer las causas. También se debe diferenciar la contaminación de la aparición de exudados, que en algunos casos si no son tratados pueden comprometen la viabilidad del cultivo. La aparición de contaminaciones endógenas es un contratiempo importante y muchas veces nada fácil de superar. Si se detecta la posibilidad de existencia de virus el problema a resolver no es de esterilización y requiere otro enfoque que trataremos mas adelante.