5.1Tipos y selección
5.2 Tipos de compuestos en el medio
5.3 Composición de medios de cultivo
5.4 Efectos de las variaciones en tipos y concentraciones
5.5 Características físicas de los medios de cultivo
    5.5.1 Medios líquidos y medios sólidos
    5.5.2 Gelificantes
    5.5.3 Potencial osmótico del medio
    5.5.4 pH
5.6 Preparación

Los medios de cultivo se definen principalmente por sus cualidades químicas, esto es, su composición; también deben definirse por sus cualidades físicas, tales como estado, salinidad, etc.

La mayoría de los medios que se utilizan tienen el nombre dado por quien los formuló; Otros surgen de modificaciones sobre los medios genéricos, que son los mas conocidos. Entre los primeros podemos citar:

1. Knudson (1946)

2. MS (Murashige y Skoog, 1962)

3. White (1963)

4. B5 (Gamborg, 1970-1976)

5. WPM (Lloyd y McCown 1980)

6. KM8p (Kao y Michayluk 1982)

La elección del medio de cultivo se realiza en función de los conocimientos previos de que se disponga: especie, cultivar, tipo de cultivo in vitro, condiciones de incubación, etc., y será en buena parte responsable del éxito o fracaso del proceso. Suele elegirse el medio más rico que permite la especie o cultivar, ya que el crecimiento será mejor.

1. Sales minerales: macronutrientes y micronutrientes

2. Vitaminas

3. Reguladores de crecimiento

4. Fuente de carbono

5. Otros compuestos orgánicos

6. Otros compuestos de uso específico

7. Gelificante (en su caso)

8. Suplementos de composición indefinida

9. Agua

Las funciones de estos compuestos pueden ser nutritivas sobre el desarrollo vegetal, pero también pueden tener funciones adicionales. Por ejemplo el Zn afecta a la síntesis de auxinas.

Las sales minerales, y principalmente los macronutrientes, además de tener cada una de ellas un papel determinado en la nutrición del explanto, son responsables de la salinidad final del medio, que determinará la mayor o menos capacidad de absorción de los nutrientes en función del tipo de especie que se cultive.

Los cultivos realizan algo de fotosíntesis pero su nutrición es mayoritariamente heterótrofa; necesitan de los compuestos minerales y también de la fuente de carbono.

Las hormonas que se precisan aportar suelen ser auxinas y citoquininas, sin embargo al prolongarse el tiempo de cultivo in vitro y realizarse subcultivos el explanto va adquiriendo la capacidad de sintetizar sus propias auxinas o citoquininas, dejando de requerir su aporte exógeno en el medio. A este fenómeno se le conoce como habituación.

• Auxinas: ácido indol-acético (IAA), ácido naftalen-acético (NAA), ácido indol-butirico (IBA), ácido 2,4-Dicloro-fenoxi-acético (2,4-D)

• Citoquininas: benciladenina (BA), quinetina (KIN)

• Giberelinas: ácido giberélico (GA3)

• Ácido abscísico (ABA)

• Otros reguladores del desarrollo vegetal

De entre ellos es frecuente la adición de auxinas y citoquininas, en diferentes proporciones en función principalmente del tipo de diferenciación a inducir y del tipo de especie a cultivar. El uso de otros reguladores es mucho más ocasional.

Hidratos de Carbono:

• Monosacáridos: glucosa, fructosa, galactosa, manosa, arabinosa, ribosa, xilosa

• Disacáridos: sacarosa, maltosa, celobiosa, trehalosa, lactosa

• Trisacáridos: rafinosa

• Polisacáridos: almidón, celulosa De entre ellos el habitualmente utilizado en los medios de cultivo es la sacarosa.

Otros compuestos orgánicos:

• Aminoácidos

• Poliaminas Su utilización es diversa: para aportar una fuente suplementaria de nitrógeno en forma amina, producir procesos morfogénicos, etc. Suplementos de composición indefinida:

• Extractos de levadura, malta, carne, vegetales (patata, maíz, raíces y rizomas)

• Jugos de frutas u hortalizas (naranja, banano, piña, tomate, patata, leche de coco)

• Caseína hidrolizada Su uso es desaconsejable por no poder darse una composición precisa del extracto añadido, pueden resultar útiles sólo en casos concretos.

Compuestos específicos:

• Antioxidantes: ácido cítrico, ácido ascórbico

• Adsorbentes: carbón activo

• Controladores del potencial osmótico: polietilen-glicol, manitol Se puede precisar su aporte a los medios en condiciones concretas.

El aporte de todos los compuestos al medio de cultivo tiene que realizarse dentro de un rango, mas o menos amplio en función del compuesto en concreto y del cultivo in vitro a realizar (especie, etc). Tanto su carencia como su exceso provoca efectos negativos en el crecimiento y desarrollo de la planta.

Para ilustrar este aspecto podemos fijarnos en el efecto de la concentración de nitrógeno sobre dos cultivares de crisantemo: para ambos hay un rango óptimo, si bien en uno las variaciones de nitrógeno afectan mucho más al crecimiento que en el otro. Idealmente, para cada compuesto debe establecerse un rango adecuado para un grupo significativo de cultivos in vitro.

Respecto a la fuente de carbono a aportar, el de uso mas general es la sacarosa, que es el azucar común y el que utilizan habitualmente las plantas. Su concentración en el medio de cultivo es del 2 al 3%, y sólo algunos tipos de cultivo especializados pueden requerir cantidades mayores. Su concentración también tiene efectos semejantes a los observados con el nitrógeno.

El rango de aporte de las homonas vegetales es más complejo de determinar, ya que actúan a concentraciones muy bajas, del orden micromolar, y el efecto que tienen no se produce tan sólo por cada hormona en concreto sino que en la mayoría de las ocasiones se debe a la cantidad relativa de unas hormonas respecto a otra u otras. Además sus efectos tienen una fuerte dependencia del tipo de planta cultivada, del tipo de desarrollo que se quiera lograr, de las características del explanto y del sistema de cultivo. Las hormonas que habitualmente se aportan a los medios de cultivo son las auxinas y las citoquininas. Sus efectos sobre el desarrollo en una escala relativa de auxinas frente a citoquininas pueden observarse en la figura siguiente. Por otra parte las relaciones entre ambos tipos de hormonas no son lineales. El aspecto de esta figura variará si las 2 hormonas concretas aportadas fueran otra auxina y otra citoquinina.

Los medios de cultivo tal y como se han formulado serán líquidos, y para que estén aireados se precisa el uso de recipientes de elevada superficie que se agitan horizontalmente a una velocidad de 100-200 rpm. Los nutrientes se distribuyen homogéneamente en el medio y son tomados con facilidad, permitiendo un crecimiento rápido. Sin embargo el cultivo en medio líquido causa problemas a diversas especies, principalmente leñosas.

Algunas alternativas a la necesidad de agitar los medios de cultivo líquidos, son el cultivo en “puente de papel” y las “membranas flotantes”, si bien ninguna de ellas ha resultado fácilmente utilizable. Otra opción es la de los medios de doble fase en que sobre un cultivo en medio sólido se añade una fina capa de medio líquido; los nuevos compuestos del medio líquido difunden en el medio sólido, de donde los tomará el explanto, modificando su patrón de desarrollo si fueran diferentes a los del medio sólido inicial; así se evita transferir el explanto de medio de cultivo para modificar su patrón de desarrollo. En este sistema no se controla la difusión de compuestos entre las dos fases.

Otra alternativa a los medios líquidos son los medios llamados sólidos o semisólidos, en los que se añade un compuesto no nutritivo que gelifica el medio.

El gelificante suele ser un sólido que al añadirse a un medio de cultivo se disuelve por calentamiento fuerte (cercano a los 100 ºC) y hace que el medio adquiera la consistencia de gel al enfriarse a temperaturas menores. Uno de los mejores agentes gelificantes de que se dispone para realizar cultivos in vitro de tejidos vegetales es el agar, también conocido como agar-agar. Los gelificantes deben cumplir con una serie de requisitos: no ser asimilado por el explanto, lo que haría que al consumirse el medio retornase a su estadio líquido, no interferir en la absorción de los nutrientes del medio de cultivo, y permanecer estable durante el tiempo de cultivo.

El agar es un polisacárido natural no ramificado y de alto peso molecular (3.000 a 160.000), extraído de algas rojas, Rhodofíceas, principalmente del género Gelidium. Está formado por galactosidos que forman la Agarosa, y de un polisacárido sulfatado, la Agaropectina. Además, contiene muy pequeñas cantidades de cationes como impurezas (Na, K, Ca, Mg, etc.). Su composición varía ligeramente en función de la especie de que se extrae, su procedencia, época de cosecha, madurez del alga, etc. Los procesos de obtención y purificación para producir los distintos tipos de agar afectan principalmente a su contenido en impurezas.

La principal característica que hace del agar un gelificante es su total disolución en agua al ser calentado a 85-100 ºC, y su gelificación alrededor de los 35 ºC. Es termoreversible, es decir, se puede volver a disolver y a gelificar repetidas veces mediante variaciones en la temperatura, y es autoclavable. Su gelificación depende del pH del medio de cultivo, siendo óptima para pH 5.4-5.7. Los medios de cultivo para tejidos vegetales suelen ajustarse a pH = 5.7 antes de añadir el agar, por lo que melifican bien; tras la gelificación el agar absorbe una cantidad de agua de hasta 200-300 veces su peso, y forma un gel muy translúcido. La preparación de los medios de cultivo para vegetales incluye generalmente un aporte de agar del 0.8%.

Se puede encontrar información detallada sobre los tipos de agar en las diferentes marcas comerciales, por ejemplo en este pdf

Entre los compuestos alternativos al agar para utilizarse como gelificantes en el cultivo in vitro de tejidos vegetales tenemos:

• Alginatos. Excelentes para cultivo de células en suspensión y de protoplastos.

• Agarosa. Es uno de los polímeros del agar, obteniéndose a partir de él. Se utiliza más en electroforesis de proteínas o ácidos nucleicos que en cultivo in vitro.

• Fitagel. Conocido también con el nombre gelrita, marca registrada de Merck; es de amplio uso.

• Ficoll. Es un derivado de polisacáridos que produce medios de cultivo de tipo coloidal. Encuentra una aplicación importante en el cultivo de anteras.

El fitagel es un polisacárido aniónico obtenido por fermentación bacteriana. El gel que forma se caracteriza principalmente por:

• Gran transparencia, que facilita el seguimiento del cultivo.

• El medio nutritivo se gelifica con un aporte de fitagel de tan sólo el 0.2%

• Precisa de cationes divalentes para su gelificación, principalmente Mg o el Ca.

• Se disuelve y gelifica en respuestas a cambios de temperaturas, como el agar, si bien no es termoreversible.

• Los explantos cultivados en medios con fitalgel absorben los nutrientes con mucha facilidad, lo que permite un crecimiento mas rápido, sin embargo la velocidad de absorción puede ser excesiva, no pudiendo incorporarse a sus estructuras y compuestos sino que quedarían en solución dentro del explanto, causando el problema conocido típicamente como hiperhidricidad, frecuente en cultivos de tipo leñoso.

•Su coste es mucho menor

Los explantos cultivados in vitro tomarán los compuestos junto con el agua del medio que absorben, siempre que el potencial hídrico del explanto sea más negativo que el potencial osmótico del medio. El potencial osmótico depende de los compuestos de medio, principalmente de los más mayoritarios: la fuente de carbono, los macronutrientes (principalmente N y K), y el gelificante en su caso.

La contribución de la fuente de carbono al potencial osmótico depende de su concentración. El gelificante tiene una contribución relativamente estable sobre el potencial osmótico, no afectándole apenas su tipo ni su concentración, que apenas fluctúa. Los macronutrientes de los medios de cultivo también son importantes de cara a su potencial osmótico total.

Concentración de sacarosa		Osmolaridad Os/k	Potencial osmótico a 25 ºC Mpa
(% p/v)	6.5nM
0.5	14..61	0.015	-0.037
1.0	29.21	0.030	-0.074
1.5	43.82	0.045	-0.112
2.0	58.43	0.060	-0.149
2.5	73.04	0.075	-0.186
3.0	87.64	0.090	-0.223
4.0	116.86	0.121	-0.300
6.0	175.28	0.186	-0.461
8.0	233.71	0.253	-0.627
10.0	292.14	0.324	-0.803
12.0	350.57	0.396	-0.982
Efecto de la concentración de sacarosa sobre el potencial osmótico del medio de cultivo

El procedimiento más adecuado para reducir el potencial osmótico del medio dependerá de estos tres factores, principalmente de los que mas aportan a dicho potencial: los macronutrientes, y/o la sacarosa; el gelificante aporta un porcentaje muy bajo del potencial osmótico final. Se pueden proponer cambios en la composición del medio de cultivo, principalmente en sus macronutrientes, y en la concentración de fuente de carbono, para modificar su potencial osmótico. El potencial osmótico real del medio es habitualmente superior al calculado teóricamente; esto se debe principalmente por la hidrólisis parcial de la sacarosa que se produce durante el autoclavado.

 

	Osmolaridad teórica (sin hidrolisis de la sacarosa)				Osmolaridad total medida mOsm/kg
Componentes del medio	Sales mOsm/kg	Agar mOsm/kg	Sacarosa mOsm/kg	Total mOsm/kg
MS + agar	96	4	-	100	-
MS + agar + 0.0% sacarosa	96	4	15	115	115
MS + agar + 1.0% sacarosa	96	4	30	130	140
MS + agar + 2.0% sacarosa	96	4	60	160	184
MS + agar + 4.0% sacarosa	96	4	121	221	276
Contribución parcial al potencial osmótico del medio de cultivo de sus componentes. (datos elaborados a partir de Lazzerl et al 1988)

 

El crecimiento de las plantas depende del pH, siendo adecuado en general un pH entre 5-5.5 y 6.5, aunque para cada especie existe un rango óptimo. En los cultivos in vitro se admite que son pH adecuados los situados entre 4.8 y 6.0; no causa el desarrollo de los explantos, pero puede limitar el crecimiento o afectar a la diferenciación.

El pH del medio se ajusta a 5.7 antes de autoclavar mediante soluciones normales de NaOH, KOH o HCl, pero desciende durante la esterilización, probablemente debido a reacciones entre los compuestos del medio al calentarlo. Este descenso depende de su composición química y del gelificante, que tiende a minimizarlo (poner figura de descenso de pH según la concentración de gelificante). Durante el cultivo el pH del medio evoluciona en función de la composición de dicho medio y del desarrollo del propio explanto, lo cual a su vez indica la cantidad y tipo de nutrientes que son absorbidos por el explanto.

En general, y especialmente si los medios contienen N en forma de nitrato y de amonio, el pH va descendiendo conforme progresa el cultivo; este descenso es oscilante, ya que primero el explanto toma preferentemente NH4+, y expulsa al medio iones H+; por tanto el pH del medio baja, lo que ralentiza la toma de NH4+ y aumenta la de NO3-, expulsándose al medio iones OH- y por tato aumentando el pH, aunque a niveles inferiores a los de partida. De esta manera se reinicia el sistema y vuelven a absorberse preferentemente NH4+ y NO3- de forma sucesiva; y el pH va oscilando y descendiendo a la vez.

La preparación de medios de cultivo es sencilla pero incluye la manipulación de múltiples sustancias. Esta preparación puede simplificarse mediante el uso de:

• Packs listos para usar, disponibles para medios frecuentemente utilizados. Habitualmente constan de medio base, sin reguladores.

• Elaboración de soluciones stock mas concentradas, agrupando los compuestos en varias soluciones stock, por ejemplo:

Stock 1: Macros (x10)

Stock 2: Sales de Calcio (x 10)

Stock 3: Micronutrientes (x 100)

Stock 4: Solución de hierro

Stock 5: Vitaminas (x 100)

Stock 6: Reguladores (cada uno individualmente)(x 200)

Estas soluciones stock se conservan en nevera (stock 1, 2, 3 y 4) o congelador (stock 5 y 6), según los compuestos que contengan, durante meses. Algunas soluciones deben conservarse en oscuridad.

Algunos aspectos relevantes al preparar el medio o las soluciones stock:

• La cantidad de un compuesto a añadir, en peso, es función de su grado de hidratación. Lo relevante es mantener la molaridad del nutriente; a igual peso del compuesto, cuanto mayor grado de hidratación menor molaridad del nutriente.

• La concentración de una solución stock está limitada por la solubilidad de sus compuestos y por las interrelaciones entre ellos. La disolución de los compuestos no debe dar lugar a reacciones entre ellos que causen algún tipo de precipitación o que disminuyan su capacidad de incorporación al explanto.

• Algunos compuestos, por ejemplo muchos reguladores de crecimiento, son poco hidrosolubles. Para preparar sus soluciones stock se disuelven en una pequeña cantidad de soluciones ácidas o básicas (OHNa 1N, HCl 1N), solventes orgánicos (ej. DMSO), o etanol, teniendo siempre presente el potencial efecto (toxicidad, efecto sobre el pH, etc.) de dichos solventes.

• Los compuestos termolábiles deben ser incorporados mediante filtración al medio ya autoclavado y a temperaturas cercas a la temperatura ambiente pare evitar su degradación.

Compuestos	Degradación por el calor	Referencias
ABA	Ligera	Catálogo Sigma
Sulfato de adenina		Liau y Boll,1970
Ácido L-ascórbico		Catálogo Sigma
L-asparagina		Liau y Boll, 1970
Pantotenato cálcico	Alta	Dodds y Roberts, 1982; Catálogo Sigma
Ácido trans-cinámico		Catálogo Sigma
Cisteina		Butenko, 1964
Benziladenina ribósido		Catálogo Sigma
Cloruro de colina		Liau y Boll, 1970
Ácido fólico		Liau y Boll, 1970
Fructosa	Substancias inhibidoras	Stehsel y Caplin, 1969
Ácido geberélico	Ligera	Butenko, 1964; Watson y Haperin, 1981
L- glutamina	Alta	Liau y Boll, 1970; Thompson et al. 1977
IAA	Degradación de un 40% en 20 minutos de autoclavado	Nissen y Sutter, 1988; Catálogo Sigma
IAA-L-alanina	Ligera	Pence y Caruso, 1984; Catálogo Sigma
IAA- L-ácido aspártico	Pronunciada	Pence y Caruso, 1984; Catálogo Sigma
IAA-glicina	Ligera	Pence y Caruso, 1984; Catálogo Sigma
IAA-L-fenilalanina	Ligera	Pence y Caruso, 1984; Catálogo Sigma
IBA	Degradación de un 20% en 20 minutos de autoclavado	Nissen y Sutter, 1988; Catálogo Sigma
Kinetina	Ligera	Catálogo Sigma
Extracto de malta	Substancias inhibidoras	Solomon, 1950
Nicotinamida		Liau y Boll, 1970
Ácido nicotínico		Liau y Boll, 1970
N,N'-dimetilurea	Total	Schmitz y Skoog, 1970
Ácido pantoténico	Alta	Dodds y Roberts, 1982; Catálogo Sigma
PBA	Ligera	Catálogo Sigma
Phloridzina		Krikorian et al. 1982
Piridoxina	Ligera	Singh y Krikorian, 1981
Riboflavina		Liau y Boll, 1970; Catálogo Sigma
2-iP	Ligera	Catálogo Sigma
2-iP ribósido		Catálogo Sigma
Tiamina	Alta a pH >5.5	Linsmaier y Skoog, 1965; Liau y Boll, 1970
L-triptófano		Butenko, 1964; Catálogo Sigma
Urea		Liau y Boll, 1970; Peters y Mayne, 1974
Zeatina	Ligera	Catálogo Sigma