8.1 Características de los explantos tras la multiplicacción
8.2 Fase 3. Preparación para la transferencia Ex-vitro
8.2.1 Enraizamiento
8.2.2 “Hardening”
8.3 Fase 4. Aclimatación
8.4 Sistemas alternativos: Micropropagación por propágulos

Los explantos resultantes de la fase de multiplicación se caracterizan habitualmente por:

• No son fotosintéticamente autosuficientes, dependen del aporte exógeno de azúcares
• Carecen de raíces
• Alto contenido hídrico
• Estructuralmente poco desarrollados
• Estomas permanentemente abiertos y carencia de buena parte de la cutícula o grosor muy reducido
• En algunas ocasiones sus entrenudos son excesivamente cortos o largos

Por lo tanto para que se transformen en plántulas completas capaces de sobrevivir y desarrollarse en el ambiente exterior precisan unos cambios para que sean:

• Totalmente autótrofos
• Capaces de absorber los nutrientes del suelo mediante un sistema radical
• Equilibrados en su contenido hídrico
• Paredes celulares y resto de estructuras mas fuertes y resistentes
• Cutícula característica de su especie y estomas totalmente funcionales
• Distancia internodal característica

Estos cambios deben realizarse en diferentes etapas, y la mayoría de forma progresiva. La mayoría de ellos pueden iniciarse in vitro, tras la fase de multiplicación, para continuarse durante las primeras etapas de cultivo ex vitro. De esta manera suelen determinarse las dos etapas siguientes, conocidas como fase 3, de preparación para transferencia ex vitro, también llamada en muchas ocasiones enraizamiento, y fase 4, de aclimatación, si bien los dos procesos suelen realizase paulatinamente durante ambas.

El punto de partida de esta fase son los explantos procedentes de la fase de multiplicación, que habitualmente no tienen raíces, o no son adecuadas para superar el proceso de transplante y ser funcionales posteriormente, por ejemplo por romperse durante el transplante al ser excesivamente largas y delgadas.

En el caso poco habitual de que los explantos tengan raíces cortas y fuertes y que éstas no se dañen tras el transplante, se podrá prescindir de realizar acciones de enraizamiento. En cualquier otro caso este enraizamiento se lleva a cabo:

• In vitro. Los explantos se cultivan en un nuevo medio de cultivo que contiene auxinas inductoras de la iniciación de raíces adventicias. Estos tratamientos se realizan durante 10-20 días en un medio semejante al utilizado en los subcultivos pero sin el objetivo de incrementar el número de explantos, por lo tanto con diferentes reguladores de crecimiento. Para inducir la formación de raíces las auxinas con que se suplementan estos medios son IBA o NAA y además se añade la vitamina riboflavina. Una vez se formen raíces cortas y fuertes, hasta un estado determinado, se procederá a transplantar la plántula a un sustrato ex vitro.
• Ex vitro. Se extraen los explantos del medio de cultivo y se someten a un tratamiento auxínico breve, equivalente al que se utiliza para enraizar esquejes. Estos tratamientos suelen realizarse mediante un baño de muy pocos minutos de nuevo con IBA o NAA, o bien aplicando estas auxinas como polvo en la parte basal de los explantos. A continuación se transfieren los explantos al sustrato ex vitro.

El término “hardening”, o endurecimiento, o fortalecimiento, engloba toda una serie de procesos complementarios a la formación de raíces y que incluyen modificaciones en los restantes aspectos de los explantos que necesitan conseguirse antes de que puedan crecer y desarrollarse con normalidad en el ambiente externo. Es decir que tratará de:

a) Activación de la fotosíntesis

b) Control de las pérdidas de agua

c) Fortalecimiento estructural

a) Activación de la fotosíntesis

Mientras el medio de cultivo sea rico en azúcares y la iluminación escasa, la nutrición del explanto será preferentemente heterótrofa. Si limitamos esta nutrición heterótrofa mediante la modificación de cualquiera de estos dos aspectos, el explanto se verá forzado a desarrollar y utilizar su maquinaria fotosintética. Por lo tanto la activación de la fotosíntesis se puede conseguir:

• Reduciendo el aporte de hidratos de carbono al medio de cultivo
• Incrementando la iluminación

Si bien ambos sistemas consiguen el objetivo de incrementar la autotrofía del explanto, la reducción del aporte de hidratos de carbono al medio de cultivo puede tener otras consecuencias negativas, principalmente la menor capacidad del explanto de acumular sustancias de reserva. El acumulo de reservas contribuye a la posterior supervivencia del explanto durante la aclimatación, ya que pasará por un estado en que debe formar nuevas hojas para realizar fotosíntesis, y que durante su crecimiento éstas son consumidoras de asimilados en vez de productoras. En conclusión, es discutible la conveniencia de reducir el aporte de hidratos de carbono al medio de cultivo.

El incremento de la iluminación es el procedimiento más ventajoso; al aumentar la cantidad de luz hasta unos 300 µM.m-2.s-1 (aproximadamente unos 15000 lux), el explanto incrementará la síntesis de pigmentos relacionados con la fotosíntesis, y a continuación se incrementará ésta.

b) Control de las pérdidas de agua

Si los explantos son extraídos del recipiente de cultivo, la incapacidad de cerrar sus estomas y la escasez o carencia de cutícula son responsables de que pierdan gran cantidad de agua inmediatamente a no ser que se coloquen en una atmósfera saturada de humedad. Para superar estas limitaciones existen varias opciones, entre ellas las más relevantes son:

Disminución del potencial hídrico del medio. Se puede conseguir mediante: Adición de un agente, Manitol, PEG, PVP, etc., que dificulte la absorción del agua y sales del medio de cultivo, sin afectar al metabolismo de la plántula

Incremento de la salinidad. No es recomendable porque tiene efectos negativos sobre el enraizamiento.

Incremento de los hidratos de carbono. A la vez facilitará el enraizamiento y el acumulo de sustancias de reserva en los explantos, si bien en algunas ocasiones también puede interferir en la activación de la fotosíntesis. En algunos casos en vez de aumentar la concentración de sacarosa se recomienda realizar una alternancia de cultivo en medios ricos y pobres en sacarosa.

Incremento del gelificante. Poco viable económicamente, si se incrementa tiene también el inconveniente de que se producirá una mayor rotura de sus raíces durante la extracción del explanto

Reducción de la humedad ambiental en el recipiente de cultivo. Puede conseguirse mediante: Refrigeración basal (“Bottom cooling”). La disminución de la temperatura basal del explanto en sólo 1ºC disminuye la HR en una media del 6%, lo que facilita la transpiración del explanto y con ello la adquisición de funciones relacionadas con el control de las pérdidas de agua. Una disminución del 5% de la HR es suficiente para incrementar el grosor de las hojas y de la cutícula y activar el funcionamiento de los estomas.

Cierres porosos. Facilitan la transpiración.

Apertura parcial de las tapas de los recipientes de cultivo. Facilita la transpiración, si bien tras la apertura de las tapas los explantos deben transplantarse en muy pocos días, pues en el caso contrario se crecerían contaminaciones sobre el medio de cultivo que afectarían al desarrollo y supervivencia de los explantos.

• Disminución del potencial hídrico del medio. Se puede conseguir mediante:
• Adición de un agente, Manitol, PEG, PVP, etc., que dificulte la absorción del agua y sales del medio de cultivo, sin afectar al metabolismo de la plántula
• Incremento de la salinidad. No es recomendable porque tiene efectos negativos sobre el enraizamiento.
• Incremento de los hidratos de carbono. A la vez facilitará el enraizamiento y el acumulo de sustancias de reserva en los explantos, si bien en algunas ocasiones también puede interferir en la activación de la fotosíntesis. En algunos casos en vez de aumentar la concentración de sacarosa se recomienda realizar una alternancia de cultivo en medios ricos y pobres en sacarosa.
• Incremento del gelificante. Poco viable económicamente, si se incrementa tiene también el inconveniente de que se producirá una mayor rotura de sus raíces durante la extracción del explanto.
• Reducción de la humedad ambiental en el recipiente de cultivo. Puede conseguirse mediante:
• Refrigeración basal (“Bottom cooling”). La disminución de la temperatura basal del explanto en sólo 1ºC disminuye la HR en una media del 6%, lo que facilita la transpiración del explanto y con ello la adquisición de funciones relacionadas con el control de las pérdidas de agua. Una disminución del 5% de la HR es suficiente para incrementar el grosor de las hojas y de la cutícula y activar el funcionamiento de los estomas.
• Cierres porosos. Facilitan la transpiración.
• Apertura parcial de las tapas de los recipientes de cultivo. Facilita la transpiración, si bien tras la apertura de las tapas los explantos deben transplantarse en muy pocos días, pues en el caso contrario se crecerían contaminaciones sobre el medio de cultivo que afectarían al desarrollo y supervivencia de los explantos.

c) Fortalecimiento estructural

En el caso de que los explantos sean excesivamente elongados deben cultivarse durante un tiempo en un medio que cause su compactación mediante el acortamiento de la distancia internodal; para ello los medios deben contener inhibidores de la síntesis de giberelinas, tales como el CCC o el paclobutrazol, ya que las giberelinas causan el alargamiento internodal.

Otras medidas que favorecen el fortalecimiento estructural de los explantos son las mismas que incrementan su actividad fotosintética (incremento de la iluminación) o que conducen al control de las pérdidas de agua, tanto disminuyendo el potencial hídrico del medio como la humedad ambiental del cultivo in vitro. La reducción general de la temperatura de cultivo también produce plantas mas fuertes estructuralmente.

Por el contrario en algunos casos los explantos pueden ser excesivamente achaparrados y con una distancia internodal muy corta, lo que dificulta su manipulación y puede reducir su posterior capacidad de supervivencia durante la aclimatación; en estos casos una acción complementaria a las anteriores es provocar un alargamiento de los entrenudos mediante la adición de giberelinas al medio en las últimas fases de cultivo in vitro. Estas aplicaciones de giberelinas pueden ser problemáticas ya que estas hormonas tienden a limitar la capacidad de enraizamiento de los explantos.

Una vez las plántulas están en un estado que permite su supervivencia en el exterior se transfieren a un sustrato y se procede a su aclimatación. La aclimatación ex vitro es el proceso mediante el cual las plantas salidas de los recipientes de cultivo in vitro y cultivadas ex vitro se van transformando podo a poco hasta que aparecen en ellas las características habituales de las plantas de su especie cultivadas ex vitro, en invernaderos o en campo. Una vez aclimatadas estas plantas pueden cultivarse en su ambiente habitual sin diferencias por haber sido obtenidas in vitro.

¿Deben aclimatarse las plantas que hayan pasado por una fase de “hardening”?. Si, todas las plantas deben pasar por la fase de aclimatación para asegurar su supervivencia. Incluso tras la fase de “hardening” las plántulas cultivadas in vitro presentan escasez de ceras epicuticulares, escasa funcionalidad estomática, paredes celulares finas y hojas poco funcionales, tanto desde el punto de vista estomático como del fotosintético. Si las plantas fueran transferidas del recipiente de cultivo in vitro a un sustrato ex vitro y no fueran sometidas al periodo de aclimatación la mayoría o incluso todas ellas morirían en unas pocas horas o días. Por ello es imprescindible su paso por una fase de aclimatación, que se realiza en el interior de un invernadero.

Las medidas que deben llevarse a cabo durante la aclimatación son:

• Evitar las contaminaciones por hongos y bacterias, así como por cualquier otro tipo de organismos.
• Evitar los daños por exceso de iluminación o temperatura.
• Incrementar la fotosíntesis hasta sus valores habituales
• Evitar las rápidas pérdidas de agua.

Los procedimientos a seguir durante el tiempo de aclimatación, que se prolonga habitualmente entre 2 y 6 semanas son:

• Extracción de los explantos del medio de cultivo, lavado con agua corriente asegurándose de eliminar todo resto de medio de cultivo, e inmersión en baño fungicida. El medio contiene azúcares que serían rápidamente atacados por los hongos y las bacterias del ambiente del invernadero. La posible presencia de organismos contaminantes durante la aclimatación debe ser vigilada con mucha frecuencia, y en caso de ser detectados deben eliminarse los contenedores infectados, e incluso se recomienda también eliminar los adyacentes ya que su propagación puede ser muy rápida.
• Según los casos, eliminación de hojas preformadas, ya que aún tras el “hardening” pueden no ser fotosintéticamente eficientes y/o permitir un exceso de pérdidas de agua. Instalación de la plántula en un sustrato estéril y dentro de contenedores también esterilizados previamente o nuevos, o al menos sometidos a un proceso de desinfección. Los contenedores con las plántulas se instalan en el interior de un túnel de aclimatación. El sustrato para la aclimatación puede ser diverso, pero tiene que drenar bien.

En algunos casos se ha ensayado la aplicación de antitranspirantes (glicerol-parafina-aceite, petróleo, PVs) para controlar las pérdidas de agua durante la aclimatación, si bien con escaso éxito.

Un buen túnel de aclimatación será aquel que:

• Disponga de un sistema que asegure el control y mantenimiento de la humedad relativa a niveles altos, superiores al 85%; esta humedad se conseguirá mediante “mist” (microgotas) o preferentemente “fog” (nanogotas). La humedad ambiental de las plántulas debe descender paulatinamente durante su aclimatación, hasta igualarse son la humedad natural del exterior; esto se consigue disminuyendo también paulatinamente la humedad en el túnel de aclimatación, es decir, reduciendo la frecuencia de “mist” o de “fog”.
• Un sistema de fertilización frecuente de las plántulas. La solución nutritiva debe ser poco salina para facilitar una abundante toma de agua por el explanto, ya que la pierde en exceso, especialmente al inicio de la aclimatación. La fertilización puede aportarse combinadamente con el sistema de humidificación.
• Disponga de una cubierta que produzca un abundante sombreado inicial, que tiene que ser hasta del 90% según la cantidad de luz natural presente en la zona en que se realice la aclimatación. Este sombreado descenderá paulatinamente y en paralelo al descenso de la humedad ambiental.
• Evite el calentamiento de los contenedores. El sombreado se utiliza inicialmente para que el exceso de luz no dañe las plantas y su fotosíntesis incremente paulatinamente, pero también para evitar este calentamiento.
• Favorezca el desarrollo de las raíces. Por su sencillez y sus buenos resultados, el calentamiento basal suele ser el sistema utilizado. Durante todo este tiempo en aclimatación las plántulas van desarrollándose, por lo que gradualmente serán transferidas a contenedores de mayor tamaño, continuando manteniéndose todas o algunas de las medidas de aclimatación.

Algunas especies producen de forma natural diferentes propágulos de reproducción vegetativa: bulbos, tubérculos, cormos, etc. Estas especies se pueden micropropagar de una forma mucho más sencilla si se consigue la inducción in vitro de estos micropropágulos. Este sistema de micropropagación consistiría en:

Fase 0. Preparación. Semejante a la vista anteriormente.

Fase 1. Iniciación. Semejante a la vista anteriormente.

Fase 2. Multiplicación. Comienza de forma semejante a la vista anteriormente y finaliza cuando se ha obtenido un determinado número de explantos.

Fase 3. Inducción de los micropropágulos. Se cambian los explantos de medio de cultivo de forma que las condiciones ambientales y del nuevo medio causen que estos explantos formen microbulbos, microtubérculos, microcormos, etc. Al final de esta fase se cosechan estos micropropágulos.

Fase de Preparación para transferencia ex vitro y Fase de Aclimatación in vitro. Estas fases ya no son necesarias utilizando este sistema.

Una vez se han cosechado los propágulos, si se quieren obtener inmediatamente nuevas plantas se pueden sembrar directamente si no tienen dormición, y si la tienen se pueden tratar para eliminarla mediante tratamientos específicos. Controlando el ambiente en el que se mantengan, estos micropropágulos también pueden almacenarse fácilmente durante un cierto periodo de tiempo, de forma que no precisan ser utilizados inmediatamente y todos a la vez, lo que es una ventaja adicional de este sistema.

Ejemplos de micropropagación por propágulos lo constituyen especies como Amaryllis, Hyacinthus, cebolla, ajo, narciso, gladiolos, orquídeas, patata, ñame, o yuca.