9.1 Las plantas y otros organismos
    9.1.1 Transmisión de virosis
9.2 Saneamiento de plantas virosadas por termoterapia
9.3 Saneamieanto de plantas virosadas por cultivo In-vitroO de ápices meristemáticos
    9.3.1 Condicionantes y desarrollo del cultivo
9.4 Alternativas al cultivo de meristemos
    9.4.1 Tratamientos combinados termoterapia-cultivo de meristemos
    9.4.2 Cultivo in vitro de callo
    9.4.3 Cultivo in vitro de nucela
    9.4.4 Quimioterapia in vitro
    9.4.5 Microinjerto in vitro
9.5 Indexado
9.6 Mantenimiento de el estado sanitario y reinfección de plantas libres de virus

Las plantas se encuentran en el medio ambiente junto con otros seres vivos, una parte de los cuales entra en contacto frecuentemente con ellas, pudiendo establecer algún tipo de relación de diferente duración y consecuencias.

Las plantas se relacionan con los hongos y bacterias del suelo a través de sus raíces, en la mayoría de los casos en un espacio en el que establecen una relación simbiótica favorable que beneficia al desarrollo de ambos tipos de organismos. De esta forma la rizosfera es la zona del suelo inmediatamente adyacente a las raíces en la que bacterias y hongos, en asociación con estas raíces, forman comunidades. En el mismo sentido las micorrizas son la relación entre los hongos del suelo y las raíces de las plantas que se produce en la mayoría de las plantas superiores de forma natural.

En otras ocasiones las plantas se relacionan con hongos o bacterias que se desarrollan en su superficie o en su interior. En algunos casos este tipo de desarrollo conjunto no se conoce que cause beneficio ni perjuicio, mientras que en otros hongos o bacterias son patógenas, esto es, se desarrollan a expensas de la planta, a la que causan daños. Los hongos y las bacterias son responsables de pérdidas millonarias en hortalizas, frutas, ornamentales, etc.;existen tratamientos con diversos compuestos químicos (fungicidas, bactericidas, etc.) para controlar y eliminar a estos patógenos y permitir que la planta recupere su desarrollo normal.

Las plantas también pueden entrar en contacto con otro tipo de entidades biológicas que necesitan introducirse en el interior de las células y utilizar su maquinaria celular para autorreplicarse, perjudicando la viabilidad y el desarrollo de la planta e incluso destruyéndola. Los más conocidos de estos organismos son los virus, que producen, entre otros, mosaicos, clorosis, deformaciones foliares, meristemos hinchados, enanismo, coloración anormal de las flores, disminuyen la producción, limitan la reproducción, marchitez o muerte. Otro tipo de organismos semejantes a los virus que igualmente precisan introducirse en las células y pueden perjudicar el desarrollo vegetal son los viroides. Los fitoplasmas son pequeñas bacterias y también son parásitos obligados responsables de muchas enfermedades de los vegetales, y sus síntomas y consecuencias pueden ser semejantes a los de las virosis. Apenas existen tratamientos químicos para sanear las plantas con este tipo de infecciones, ya que afectarían también negativamente a la propia planta; los tratamientos alternativos más recomendables son la termoterapia y el saneamiento mediante técnicas de cultivo in vitro.

Las plantas adquieren virus y otros tipos de organismos que precisan introducirse en las células vegetales para desarrollarse al ser infectadas por contacto directo con organismos vivos portadores, principalmente áfidos u otros tipos de insectos, pero también pueden transmitir las virosis otros seres vivos de mayor tamaño que entren en contacto con los tejidos internos de la planta.

Los virus no se transmiten nunca directamente de una a otra planta, ni mediante el ambiente abiótico. Para evitar la infección de los vegetales es suficiente cultivarlos en zonas donde no haya vectores de transmisión, estando definidas zonas geográficas o estacionales de seguridad donde puede cultivarse una determinada especie con un riesgo de infección por debajo de un umbral; en esas zonas se puede producir material vegetal catalogado como “libre de virus”, lo cual será certificado legalmente tras los análisis correspondientes. Si la especie es resistente al frío será relativamente sencillo disponer de zonas para la obtención del material certificado, mientras que cuanto más sensible al frío sea la especie más difícil será su producción libre de virus. Una vez los virus se introducen en la planta, habitualmente en su floema, se desplazan en su interior a largas distancias por los tejidos vasculares, infectando zonas distantes del punto de inoculación en pocas horas.

Una vez en tejidos específicos, los virus también pueden desplazarse directamente célula a célula, pero con una capacidad y velocidad de infección mucho más lenta y limitada. Por esta razón es poco probable que los virus se introduzcan en zonas de la planta sin vascularizar, como los meristemos.

Las plantas que se propagan vegetativamente transmitirán las virosis que contengan, mientras que en la mayoría de las ocasiones las que se reproducen sexualmente forman semillas sin virus. Por lo tanto la incidencia de virus a través de las sucesivas generaciones irá aumentando en las especies de propagación vegetativa, y la planta se verá cada vez mas limitada en su desarrollo. En fresa se han informado aumentos en la producción al eliminar virosis de más de un 300%. El saneamiento de una planta no evita la posterior reinfección, para lo cual se precisa mantenerla en un ambiente aislado de los posibles vectores transmisores de virus, esto es, en las zonas de seguridad; en este ambiente las plantas se podrán reproducir vegetativamente sin riesgo.

La termoterapia venía siendo desde hace muchos años prácticamente el único tratamiento efectivo para eliminar los virus de un material vegetal. Consiste en someter a la planta virosada a temperaturas anormalmente elevadas durante un periodo de tiempo, de forma que el calor inactive al virus sin inactivar totalmente a la planta. La termoterapia puede aplicarse por inmersión en agua caliente, o más habitualmente en la atmósfera. La temperatura y el tiempo de tratamiento varían en función de la especie y del virus a eliminar, si bien son frecuentes tratamientos en torno a los 35-42ºC durante 2 a 8 semanas.

Para dañar lo menos posible a la planta el aumento de temperatura se realiza de forma gradual, incluso en algunos casos interrumpiéndolo con periodos cortos de cultivo a temperaturas inferiores, de forma que se recupere la planta. Es importante también que las plantas estén en un estado de desarrollo vigoroso al iniciar la termoterapia. A pesar de ello, algunas combinaciones de especie vegetal-virus requieren temperaturas de inactivación del virus incompatibles con las de la supervivencia de la planta, por lo que la termonaterpia no es posible. El conocido “cultivo de meristemos” resulta una técnica alternativa a la termoterapia, mucho más eficiente, y que también puede aplicarse en estos casos.

Las razones por las que el cultivo in vitro de ápices meristemáticos puede sanear individuos virosados son:

• Ausencia del virus en zonas de la planta no vascularizadas: los ápices meristemáticos. Es la razón principal, la más probable y por la que se inició la técnica, sin embargo estudios posteriores sugieren que existen otras razones complementarias que se comentan a continuación:
• Inactivación vírica por daños al tomar el explanto. Los cortes para su extracción pueden contribuir a inactivar el virus.
• Actividad metabólica elevada del explanto. Los virus se desarrollan en competencia con el metabolismo de la planta, por lo tanto si éste se mantiene elevado se limitará el desarrollo vírico.
• Inactivación vírica en zonas específicas: meristemos. Se atribuye esta inactivación al contenido hormonal de la zona meristemática.
• Inactivación vírica por la composición hormonal del medio de cultivo: auxinas y citoquininas.

El saneamiento de una planta infectada mediante cultivo de ápices meristemáticos consiste en cultivar in vitro un fragmento no infectado de la zona meristemática hasta producir un explanto libre de virus. A partir de ese explanto puede desarrollarse una nueva planta que será aclimatada ex vitro transfiriéndola a una zona de seguridad, o bien preferentemente se mantendrá in vitro para su micropropagación, produciendo así todo un clon de plántulas libres de virus que posteriormente se aclimatarán ex vitro. La eficiencia de esta segunda opción es mucho mayor, ya que a partir de una sola planta contaminada se podrán obtener millones de plantas sanas.

¿Cuál es el tamaño máximo de explanto que podemos tomar para eliminar los virus de una planta?. El meristemo de una planta es la porción terminal de su tallo, de unas 100 µm, formado exclusivamente por células meristemáticas, no diferenciadas y con alta capacidad de división celular. El cultivo in vitro de meristemos es relativamente complejo, tanto desde el punto de vista de su manipulación como de su viabilidad, simplificándose si se incrementa el tamaño del explanto. Los virus se transmiten por los tejidos vasculares de la planta, por lo que el tamaño del explanto podrá incrementarse siempre que no incluya estos de tejidos, como máximo 1000 µm, lo que es un ápice de tallo, que contiene el meristemo y varios primordios foliares. En general un ápice de tallo no producirá plantas libres de virus. Los explantos entre 100 y 1000 µm, llamados ápices meristemáticos, contienen el meristemo y los primeros primordios foliares; en general son los explantos utilizados para el saneamiento de los vegetales, ya que la presencia de primordios foliares facilita el cultivo. El tamaño final a elegir dependerá de la capacidad de invasión que tenga el virus en la planta, y será el máximo que permita la obtención de plantas sanas, en muchos caos alrededor de las 500 µm.

El cultivo de ápices meristemáticos se inicia con la esterilización de un fragmento de la planta virosada, a partir del que se extraerá el ápice meristemático a cultivar. La extracción de este explanto debe hacerse en la cabina de flujo laminar, con ayuda de una lupa binocular iluminada con luz fría para evitar su desecación por calentamiento. Si es posible debe humidificarse el ambiente de extracción, ya que el constante flujo de aire en la cabina también tiende a desecar el explanto. Para esta extracción se debe utilizar instrumental especialmente adaptado.

Una vez se separa el ápice meristemático del fragmento vegetal esterilizado, se introduce en el recipiente de cultivo de forma que quede en contacto con el medio, no siendo relevante la posición del explanto pero si hay que evitar que quede cubierto por agua residual del medio de cultivo; por esta razón muchas veces se cultivan los explantos en medios gelificados en posición inclinada, o alternativamente se cultivan en medios líquidos en “puente de papel”.

Son varios los factores que contribuyen a que un explanto como el ápice meristemático, sin apenas diferenciación y de muy pequeño tamaño, pueda desarrollarse in vitro. Los principales son:

• Composición del medio de cultivo. Es adecuado un medio rico en sales, como el MS; el contenido de K también debe ser elevado. Suele requerirse el aporte de auxinas y citoquininas, y algunas veces también de giberelinas para favorecer el alargamiento del explanto.
• Tamaño del explanto. Como se ha mencionado antes, el mejor es el máximo que permita el saneamiento; para ello se recomienda realizar pruebas preliminares.
• Localización de la síntesis de auxinas. Las auxinas se sintetizan en los primordios foliares, de ahí la relevancia que el explanto los tenga para ser menos dependiente de su aporte al medio de cultivo
• Condiciones de cultivo: iluminación. La iluminación puede perjudicar al desarrollo de los ápices metistemáticos, ya que sus células tienen paredes celulares delgadas y escasa diferenciación. Se recomienda iniciar el cultivo con luz tenue o incluso en oscuridad.
• Estado fisiológico del explanto. Una alta tasa de crecimiento del explanto acelera el inicio de su desarrollo y favorece su supervivencia.
• Momento de toma de explanto. Está relacionado con el mayor o menor vigor del explanto y con su tasa metabólica. En general deben iniciarse los cultivos cuando la planta madre se encuentra en su mayor estado de desarrollo, por ejemplo en primavera si saneamos plantas leñosas que sufren reposo invernal.

Si el cultivo se realiza de forma adecuada los ápices meristemáticos, sin formar callo, van a ir desarrollándose para formar una plántula.

Una vez se forma un tallo con diversos nudos puede enraizarse y aclimatarse directamente o bien iniciar un programa de micropropagación que comenzaría por la fase de multiplicación.

A pesar de la eficacia del cultivo de ápices meristemáticos en algunos casos los virus alcanzan a las células de los meristemos, con lo que esta técnica no resulta suficientemente eficaz. En esas situaciones puede intentar aplicarse alguna de las siguientes alternativas.

Combina ambos tratamientos. Puede aplicarse primero termoterapia sobre la planta entera y a continuación tomar de ella un fragmento del que obtener el ápice meristemático a cultivar in vitro, o alternativamente puede iniciarse un cultivo in vitro de sus ápices meristemáticos, someter a termoterapia dichos cultivos in vitro una vez se hayan empezado a desarrollar, y a continuación a partir de estos cultivos in vitro volver a obtener ápices meristemáticos con los que realizar un subcultivo, supuestamente ya libre de virus.

Si bien la micropropagación mediante organogénesis indirecta no es un procedimiento generalmente recomendable, cuando existen dificultades para el saneamiento mediante cultivo de ápices meristemáticos de una población de plantas virosadas puede intentarse solucionarlas mediante el cultivo de callo. Éste se iniciará con cualquier fragmento de la planta, preferentemente de las zonas meristemáticas, ya que suelen tener menor grado de infección. Se ha observado que un determinado porcentaje de plantas regeneradas a partir de estos callos están libres de virus, las razones de ello pueden ser:

• Algunas de las células del explanto de partida, pero no todas, son portadoras del virus. La presencia o no de virosis en las plantas regeneradas dependerá de si las células iniciales del explanto están o no virosadas, y de la transmisión de virus entre las células del callo.
• La falta de conexiones vasculares en el callo limita la propagación del virus entre sus células.
• El callo tiene una alta tasa de división celular, por tanto una alta tasa metabólica con la que competirá el virus.
• Los reguladores de crecimiento indicados para la proliferación del callo pueden contribuir a limitar la del virus.
• Pueden sintetizarse localmente en algunas zonas del callo sustancias de resistencia al virus.

La nucela es el tejido de la parte interna del primordio seminal, es decir, de la estructura que contiene al gametofito femenino que cuando madura origina la semilla; está rodeada por los tegumentos y envuelve al saco embrionario. La nucela es un tejido diploide que forma parte del esporófito de la planta, pero que no tiene conexiones vasculares con el resto del cuerpo de la planta. Por su ubicación y su falta de conexiones vasculares muchas veces está libre de virus a pesar de que la planta en la que esté se encuentre virosada. Por estas razones en varias especies se han regenerado plantas sanas a partir del cultivo in vitro de callo procedente de nucela.

Se viene trabajando hace tiempo en el desarrollo de compuestos químicos que limiten o eliminen los virus. Existen algunos cuyo aporte al medio de cultivo puede contribuir a la eliminación de los virus.

Mención especial en cuanto al saneamiento merecen algunas especies en las que el cultivo de ápices meristemáticos produce tejidos sin virus pero que no presentan capacidad de enraizamiento, no permitiendo la regeneración de plantas completas. En estos casos se ha desarrollado una técnica que combina el cultivo in vitro de ápices meristemáticos con los procedimientos de injerto, que al realizarse in vitro se denominan microinjerto y que utiliza dos tipos de explantos:

1. El explanto que constituye el patrón, el sistema radical, que debe estar libre de virus todo él. Se toma el sistema radical con un fragmento de la parte aérea o simplemente un esqueje con capacidad de enraizamiento.
2. El explanto que constituye la variedad. Este explanto será el ápice meristemático procedente de la planta que se pretende sanear y que se injertará en el explanto anterior. Ambos tipos de explantos se desarrollarán conjuntamente in vitro y posteriormente se aclimatarán resultando una planta libre de virus.

El indexado consiste en la comprobación de la ausencia de virus en las plántulas producidas mediante el cultivo de meristemos. El indexado es específico para cada virus, es decir, la certificación se realiza sobre la ausencia de virus concretos, sin poderse certificar en ningún caso la ausencia de virus en general. No obstante, el cultivo in vitro de ápices meristemáticos es efectivo para la eliminación de un buen número de virus de distinto tipo, así como de otros entes biológicos (viroides, fitoplasmas,…) que tienen sistemas de propagación, localización celular, etc. coincidentes con los virus. El indexado informa sobre el porcentaje de plantas sanas y virosadas. Puede realizarse utilizando diferentes procedimientos, entre ellos:

• Plantas sintomáticas in vitro. Cualquier plántula in vitro que muestre aspectos coincidentes con los de las plantas virosadas (mosaicos, enrollamientos, etc.) debe eliminarse.
• Plantas indicadoras. Una plántula sin síntomas también puede tener virus; para comprobarlo puede tomarse una de sus hojas e injertarla sobre una planta de una especie indicadora; en caso de que la hoja contenga virus la planta indicadora mostrará en pocos días síntomas de la virosis.
• Test serológicos (técnicas ELISA). Alternativamente al uso de plantas indicadoras puede utilizarse este tipo de test que pone en evidencia la presencia de un virus mediante una reacción enzimática, siempre que pueda disponerse del anticuerpo correspondiente. Este test es rápido, con una reacción muy específica y aplicable simultáneamente a gran número de plántulas.
• Analisis de ácidos nucléicos. Estos análisis pueden permitir detectar secuencias de DNA específicas del virus.
• Microscopía electrónica. La visualización del virus mediante técnicas de microscopía electrónica no es sencilla, pero es evidencia directa de su presencia. Sin embargo no puede decirse lo contrario: la no visualización no garantiza la ausencia del virus

Las plantas que han sido liberadas de virus pueden volver a adquirirlos posteriormente en el campo infectándose en cualquier momento. Para evitar nuevas contaminaciones el único procedimiento es impedir el contacto de estas plantas con los vectores de las virosis, esto es, cultivarlas en espacios aislados (con mallas, etc.) o en ambientes en que no existan los vectores (las zonas frías de seguridad antes mencionadas). Alternativamente, un buen sistema puede ser mantener un stock de plantas libres de virus conservándolas in vitro durante periodos de tiempo relativamente prolongados. De cara a la posible reinfección de una planta con el virus debe conocerse el fenómeno de la protección cruzada, por el cual la infección de una planta por una raza tenue o no severa de un virus la protege contra la infección y daño de otra raza relacionada de mayor severidad.